1- Tạo cây đầu dòng sạch bệnh bằng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng

Nguyên tắc làm sạch bệnh của phương pháp này dựa vào đặc điểm lây lan của bệnh vàng lá greening (VLG) và các bệnh virus của cây có múi:

- Bệnh chỉ lan truyền trong cây theo mạch dẫn

- Bệnh không lây lan qua hạt.

Đỉnh sinh trưởng gồm mô phân sinh chưa hình thành mạch dẫn do vậy sạch bệnh. Ghép mảnh mô phân sinh lên mầm cây mọc từ hạt sẽ nhận được cây sạch bệnh. Cách ghép này chỉ thực hiện được trong phòng thí nghiệm dưới kính hiển vi do mảnh ghép mô phân sinh có kích cỡ rất nhỏ 100 - 150 nanomet (100 - 150 phần nghìn mét) và gốc ghép chỉ là đoạn mầm mọc từ hạt nuôi trong ống nghiệm. Vi ghép được thực hiện trong điều kiện vô trùng nên hoàn toàn sạch bệnh.

Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng bao gồm các giai đoạn: chuẩn bị gốc ghép, chuẩn bị đỉnh sinh trưởng, vi ghép nuôi cây trong ống nghiệm và sau đó đem trồng ra chậu.

Chuẩn bị gốc ghép lần 1:

- Xử lý hạt để gieo làm cây gốc ghép: lấy hạt của các giống cam 3 lá và bưởi chua, được bóc sạch vỏ và khử trùng bằng dung dịch Javel 1% trong 5 phút.

- Hạt được gieo trên môi trường thạch có chứa chất dinh dưỡng (môi trường MS) ở trong ống nghiệm và đặt trong buồng tối nhiệt độ 28oC.

- Tiêu chuẩn cây gốc ghép: chiều cao 10 - 12 cm, đường kính thân 1,5 - 2 mm.

Chuẩn bị đỉnh sinh trưởng:

Đỉnh sinh trưởng được lấy từ các chồi non của những cây giống gốc đã được tuyển chọn trên vườn sản xuất hay trong nhà lưới cách ly. Sau khi thu chồi non, tỉa những lá to xung quanh, chỉ giữ lại phần ngọn của chồi dài khoảng 1 - 1,5 cm.

Kỹ thuật vi ghép:

Cây giống cần làm sạch. Tỉa lá xung quanh. Cắt đỉnh sinh trưởng. Vị trí đặt đỉnh sinh trưởng bệnh. Sau 10 ngày tỉa lá, ở gốc ghép các chồi non mọc ra.

Cây gốc ghép 15 ngày tuổi được lấy ra khỏi ống nghiệm, cắt ngọn ở phía trên cách cổ rễ 2 - 2,5 cm; rễ cọc cũng được cắt bớt chỉ để lại 4 - 5 cm.

Dùng dao vi ghép và kính lúp soi nổi để mở miệng ghép trên gốc ghép, phải thận trọng để tầng sinh gỗ không bị tổn thương.

Đỉnh sinh trưởng là phần mô phân sinh dài khoảng 100 - 150 nm, dùng dao lưỡi mỏng cắt và đặt nhanh vào vị trí ghép trên gốc ghép.

Cây con sau vi ghép được đặt trong ống nghiệm có sẵn môi trưởng lỏng (môi trường MS + đường saccaro). Cây được bảo quản ở nhiệt độ 28oC, cường độ ánh sáng 1000 lux trong 16 giờ hàng ngày bằng đèn huỳnh quang.

Sau 1 tuần dùng kính lúp để kiểm tra xem chồi ghép có sống không. Nếu chồi ghép sống, chỉ 1 tháng sau đã có thêm 2 lá mới, đạt tiêu chuẩn ghép lần thứ 2.

Kỹ thuật ghép lần 2

Sau khi ghép lần 2, cây được bao chùm túi nilon khoảng 3 tuần. Nếu cây ghép sống, chuyển cây ra chậu to và bảo quản trong nhà lưới chống côn trùng.

Những cây sau vi ghép được chăm sóc đầy đủ và được giám định bệnh bằng kỹ thuật PCR, ELISA.

2- Công nghệ sản xuất cây giống sạch bệnh

-  Hệ thống nhà lưới ba cấp

* Nhà lưới cấp 1, bảo quản cây giống gốc sạch bệnh:

Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng tạo ra được các cây đầu dòng sạch bệnh. Những cây giống gốc sạch bệnh được giữ và chăm sóc trong nhà lưới chống côn trùng cấp 1.

* Nhà lưới cấp 2, bảo quản các cây S1 nhân mắt ghép sạch bệnh.

Những cây So cung cấp mắt ghép để ghép lên các gốc ghép thích hợp cho ra các cây S1, những cây này được bảo quản trong nhà lưới cấp 2 để nhân hàng loạt mắt ghép sạch bệnh. Những cây S1 cũng được giám định bệnh thường kỳ 3 tháng/lần. Những cây dương tính tiếp tục được loại bỏ. Cây S1 sẽ được lấy mắt ghép để nhân giống trong 3 năm, sau đó phải thay đợt cây S1 mới.

* Nhà lưới cấp 3, sản xuất cây giống sạch bệnh để cung ứng cho sản xuất.

Các mắt ghép sạch bệnh từ các cây S1 được cung ứng cho các nhà lưới cấp 3 để sản xuất cây giống sạch bệnh. Gốc ghép sẽ được chọn sao cho thích hợp với mắt ghép tuỳ theo mục tiêu sản xuất.

2.2. Quy trình sản xuất cây giống sạch bệnh ở nhà lưới cấp 3.

Chuẩn bị gốc ghép:

1. Chọn giống làm gốc ghép: hiện nay có nhiều giống để chọn làm gốc ghép cho cây có múi. Theo khuyến cáo của các chuyên gia đầu ngành, chúng ta có thể dùng bưởi chua để làm gốc ghép cho các loại bưởi, dùng chấp hoặc cam 3 lá để ghép cho các loại cam và quýt.

2. Thành phần nền đất gieo hạt gốc ghép: gồm 1/3 đất màu + 1/3 cát vàng + 1/3 mùn hữu cơ được hấp khử trùng bằng hơi nước nóng 100oC trong 60 phút.

3. Gieo hạt: khoảng cách gieo hạt là 3 x 3 cm. Gieo xong lấp hạt 1 cm bằng đất nhỏ mịn, sau đó dùng ván ấn chặt mặt luống. Tưới nước đủ ẩm hàng ngày.

4. Chăm sóc cây con: khi cây có 4 lá thật, bắt đầu phun phân bón lá để thúc cây sinh trưởng khoẻ (dùng loại phân bón lá có các nguyên tố vi lượng).

Cây con cao 12 - 15 cm có 5 - 6 lá thật là đủ tiêu chuẩn ra ngôi, cây được chuyển qua giai đoạn ra ngôi chờ ghép.

5. Kỹ thuật ra ngôi và chăm sóc cây con chờ ghép.

Cây con gốc ghép được cấy vào các túi bầu polyetylen đựng hỗn hợp nuôi cây.

* Hỗn hợp trong túi bầu ươm cây con:

Gồm: 1/3 đất màu + 1/3 cát vàng + 1/3 mùn hữu cơ + 100 g/bầu phân NPK.

* Túi bầu: sử dụng túi polyetylen mầu đen, kích cỡ 16 x 35 cm.

* Tiêu chuẩn cây gốc ghép:

- Chiều cao cây 40 - 50 cm, đường kính gốc đạt 0,3 cm.

- Cây mọc thẳng, khoẻ mạnh, không bị sâu bệnh hại.

Chuẩn bị mắt ghép:

Mắt ghép phải được lấy từ các cây S1, chỉ dùng mắt thức (mắt đã nổi rõ), không lấy mắt ghép trên cành còn non (cành phải được 3 tháng tuổi trở lên).

* Phương pháp ghép:

- Ghép theo phương pháp mắt nhỏ có gỗ hoặc ghép nêm.

- Vị trí ghép cách mặt bầu 20 cm.

* Thời vụ ghép: cây có múi có thể ghép tốt từ tháng 3 - 10.

Chăm sóc cây con sau ghép:

- Tỉa bỏ chồi mọc ra từ gốc ghép.

- Dùng phân bón lá để nuôi cây trong cả quá trình chăm sóc.

- Phân loại cây con theo từng lô đồng đều về sinh trưởng để các cây không che khuất lẫn nhau.

- Bấm ngọn tạo tán ngay từ khi chồi ghép cao 20 cm, có 5 - 6 lá, để lại 2 - 3 chồi tạo cành cấp 1 sau này cho cây.

- Thường xuyên kiểm tra sâu bệnh hại để phòng trừ kịp thời.

- Khi cây đủ tiêu chuẩn xuất vườn, phải giám định bệnh cho cây bằng kỹ thuật PCR, ELISA. Cây bệnh được phát hiện sớm và loại bỏ ngay.

Phương pháp lấy mẫu để giám định bệnh cho các lô cây giống: mỗi mẫu 50 cây, mỗi cây lấy 2 lá bánh tẻ. Nếu mẫu nào dương tính phải thử lại bằng cách chia lô nhỏ hơn, 10 cây/mẫu. Nếu vẫn còn mẫu dương tính phải thử lại từng cây để phát hiện chính xác cây nào đã bị nhiễm bệnh, cây đó phải được loại bỏ ngay ra khỏi vườn.

Khả năng chống chịu bệnh Phytophthora và Tristeza của một số loại gốc ghép cho cây có múi. (By W. W. Ko - Citrus diseases in Malaysia, 1991).

Ghi chú:    - Nhiễm trung bình                        - - Rất nhiễm

                + Chống chịu trung bình                ++ Rất chống chịu

* YÊU CẦU CƠ BẢN TRONG SẢN XUẤT CÂY GIỐNG CÂY CÓ MÚI SẠCH BỆNH

1- Xây dựng hệ thống nhà lưới nhân cây giống cây có múi sạch bệnh cách vùng bệnh ít nhất 3 km. Có thể tạo ra khoảng cách này bằng cách loại bỏ tất cả các cây có múi trong vùng bán kính nêu trên.

2- Dùng nước nóng để xử lý hạt gốc ghép (55oC trong 50 phút).

3- Dùng mắt ghép sạch bệnh lấy từ vườn nhân mắt ghép S1.

4- Kiểm dịch chặt chẽ để bảo vệ vườn ươm. Không được đưa nguồn bệnh vào vườn ươm bằng bất cứ con đường nào.

5- Xung quanh vườn ươm phải có hàng rào chắn gió. Các nhà lưới chống côn trùng phải có buồng ra vào 2 cửa. Giữa 2 lần cửa có đủ điều kiện khử trùng dày dép, quần áo, mũ... để ngăn vi sinh vật hoặc côn trùng theo người vào nhà lưới. (Hỗn hợp vôi bột 80% + Sunfat Đồng 20% được rải xuống nền).

6- Không cho người lạ vào thăm, trừ khi họ đã được khử trùng dày dép, quần áo, mũ... và được khoác bộ quần áo sạch chuyên dùng.

7- Khử trùng dụng cụ dao kéo trong quá trình làm việc trong nhà lưới bằng nước Javen 10%. Luôn kiểm tra chất lượng nước tưới.

8- Luôn luôn phân cách phần cũ và phần mới của vườn ươm hoặc các vùng gồm các cây khác nhau.

9- Định kỳ 3 tháng/lần giám định bệnh cho tất cả các lô cây giống, xác định và loại bỏ ngay các cây có kết quả dương tính (bị bệnh): greening, tristeza, loét vi khuẩn, exocortis, tatter leaf, psorosis...

10- Các cây giống phải có phiếu ghi rõ tên cây gồm gốc ghép, mắt ghép. Trước khi xuất vườn, các cây giống đều phải có chứng chỉ sạch bệnh.

Tiêu chuẩn cây giống chất lượng cao:

- Cây sinh trưởng khoẻ, thân thẳng, không có lá dị dạng.

- Đường kính thân cách gốc 10 cm đạt 10 - 15 mm.

- Cành ghép khoẻ, dài từ 30 cm trở lên.

- Đúng giống.

- Không có triệu chứng bị sâu bệnh hại.

- Được cơ quan có thẩm quyền cấp chứng chỉ cây giống chất lượng cao.